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本文标题："荧光蛋白嵌合体通常在N端或C端加入融合结构"
新闻来源：未知 发布时间：2017-3-13 1:07:00 本站主页地址：http://www.jiance17.com
荧光蛋白嵌合体通常在N端或C端加入融合结构
程是相似的。荧光蛋白嵌合体通常在N端或C端加入融合结构。2．
获取目的蛋白N端或C端结构一功能的知识将有助于避免干扰母体蛋
白的功能和／或
定位。而且，了解每个末端表达定位的亚细胞环境对嵌合体的设
计将是有用的。例
如，如果可能的话，避免把GFP加入到酸性蛋白水解环境中的蛋
白末端(如溶酶体
内腔)，如果没有相关知识，最初可制备N端和C端都连接GFP的嵌
合体。3a．末端插入连接子：如果N端和C端都包含决定目标蛋白功
能和定位的结构域，则
在它和荧光蛋白之间插入短的连接肽以减少位阻的影响。3b．
包埋插入：也可以把荧光蛋白插入到分子的基本序列中，通常在未
结构化的环形
区域内。如果其他方法失败可考虑此种方法，但不能保证成功
。4．某些情况下，把编码荧光蛋白的eDNA插入含有编码目标蛋白D
NA的质粒更容易。
此时，根据目标蛋白是N端融合还是C端融合，应格外注意荧光蛋
白的5’端和
3’端。5．如果产生的是N端融合(指GFP连接到目标蛋白的N端)
，贝Ⅱ必须合理设计GFP
编码区域的两个末端。把Kozak序列和GFP翻译起始密码子结合起
来将会保证
mRNA的高效翻译，同时应该删除GFP的终止密码子或者将其转化
成编码氨基酸。6．如果产生的是C端的融合，则删除目标蛋白的终
止密码，或者将其转化为一个编码
氨基酸；保存GFP的终止密码子。7．另外也可以把编码目标蛋白
的cDNA插入到含有编码荧光蛋白DNA的质粒中。在
很多情况下，这种方法更简单，因为许多可以表达荧光蛋白的质
粒可以买到。这些
质粒通常包含一个巨细胞病毒(CMV)连接的早期启动子(在哺乳动
物细胞内高效
表达)，一个包含了许多独特的限制性核酸内切酶识别位点的多
克隆位点(MCS)
(促进嵌合体的产生)，一个可使质粒在细菌种选择性扩增的具抗
生素抗性的区域，
通常包括G418筛选基因。与上面所描述的荧光蛋白的插入一样，
目标蛋白插入到
这些质粒中也具有同样的限制。8．如果产生的是C端融合，则把
目标蛋白的eDNA插入到一个荧光蛋白编码序列的5’
端含有MCS的质粒中。删除目标蛋白的终止密码子，或者将其转
化为一个编码氨基
酸，插入一个含有目标蛋白翻译密码子的Kozak序列。9．如果产
生的是N端融合，则把目标蛋白的eDNA插入到一个荧光蛋白编码序
列3’端
含有MCS的质粒中(荧光蛋白编码区的翻译起始段含有Kozak序列)
。删除荧光蛋
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