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在梯度凝胶中分离蛋白质
与均一浓度的凝胶相比,聚丙烯酰胺浓度呈梯度增加的凝胶能
分辨的蛋白质分子质量范围更宽,特别是小分子质量范围的蛋白质
条带更为清楚。与均一凝胶不同,梯度凝胶分离蛋白质更容易描绘
出分子质量为10~200kDa的线性曲线,这更有利于计算蛋白质的分
子质量。
硫酸铵,丙烯酰胺重溶液应一直保持冰浴,以防在使用时因加入
了过硫酸铵而发生
聚合。在梯度胶混合器的输出阀和两液槽之间的连通阀处于关闭
状态时,制作一块
0.75 mm厚的凝胶,在储液室加入7 m1丙烯酰胺凝胶轻(低浓度)
溶液。3.稍稍打开连通阀,让少量(约200“1)轻溶液通过阀门流
入混合室。在混合室中加
入7 ml丙烯酰胺凝胶重(高浓度)溶液。向两液室的丙烯酰胺溶液
中加入特定量的
过硫酸铵,且每7 ml溶液加入约2.3“l TEMED,并以一次性吸
管加以混匀。4.完全打开连通阀。打开磁力搅拌器,调整速率使
混合室中液体稍起漩涡即可。5.慢慢调节输出阀,调流速至2 ml
/min。6.从夹层的顶部加入凝胶液体,将吸头对着夹层的一面使
液体紧沿一片玻璃平板而下,
重的液体先流入夹层,接着是逐渐越来越轻的液体。待轻溶液全
部流人输出管时,
要加倍注意,并调整流速以保证最后的少量液体不会很快地流入
夹层以致扰乱梯度。7.在梯度胶的顶部加入水饱和异丁醇,让凝
胶聚合1h。
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