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TIREM技术的优势
理论上,BCM中所有含细菌叶绿素的自养微生物都能够被IREM
法检测到。然而在实际的野外海水样中,由于蓝细菌的丰度很大以
至于能够造成BCM计数的严重误差。而其他的光合自养生物由于丰
度较小或者细胞体积较大而不会造成BCM显微计数的干扰。在这里
,集中解决的对象是主要的自然干扰者——蓝细菌,尤其是在大洋
广泛分布丰度又高的原绿球藻。基于红外落式
荧光显微镜、CCD自
动成像和图像的数字化处理,为相同显微镜视野下的红外细胞和蓝
细菌细胞提供了精确的计数。
在落式荧光技术的应用中,若目标细胞太小或胞内色素含量太
低,常规设置的适用性一一尤其是激发光波长和强度都应在应用前
进行检测。以原绿球藻为例,理论上,原绿球藻的最佳激发光是45
0~480 nm;但原绿球藻在这些激发光下很难进行显微计数,因为
检测时450~480 nm的激发光会使原绿球藻细胞淬灭得太快以至于
显微镜系统无法得到可信的数据。
原绿球藻细胞的观察可维持一个更长的时间,从而使数据的获得更
加容易。因此在TIREM法中统一采用546±12 rim的激发光,对聚球
藻和原绿球藻进行激发检测。
当聚球藻和原绿球藻同时存在于样品中时,由于这两类主要的
蓝细菌群发出不同强度水平的荧光,因此对蓝细菌进行时间序列成
像是必要的。单位时间里强荧光颗粒所发出的光子要比弱荧光颗粒
发出的光子多,因此CCD在曝光时间内接受了绝大部分的来自强荧
光颗粒的光子,从而强荧光颗粒能够在图像中被清楚的显示,而弱
荧光颗粒则不能从背景噪音中区别出来。
经过一段时间的激发光曝光后,聚球藻细胞的荧光衰退到一定
程度,原绿球藻细胞才逐渐变得可见。虽然聚球藻和原绿球藻的绝
对荧光强度随着曝光时间的延长而下降,但根据荧光淬灭动力学理
论,荧光衰退也符合半衰期原理,因此在相同时间下强荧光的衰退
程度要比弱荧光的衰退程度显著。
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