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当FP强度很低或者表达水平必须控制在最低水平,就需
要考虑高效率CCD相机。如果时间分辨率非常重要,那么电
子倍增CCD 可以提供有效的解决办法,虽然这种办法很昂贵。
最后在PMT 技术中的突破,已经大大提高了激光扫描共
聚焦显微镜的检测效率,使用原系统很难做的实验现在可以
用新型共聚焦显微镜轻易完成,
虽然以上讨论了一些活细胞成像需考虑的要点,但最终
结果的好坏还要归结到信噪比。
不带光谱检测的多色成像应用滤光片组进行荧光多色成
像需要重点考虑滤光片的交叉干扰,滤光片干扰意味着一个
FP的荧光信号溢出到另一个信号通道中。
这种干扰既可发生于FP的激发也可发生于发射。两个或
更多荧光团之间的激发干扰作用于光谱的蓝光部分,而发射
干扰作用于光谱的红光部分。例如,GFP 通常可以通过红光
发射滤光片检测到,而红色荧光蛋白通常不能通过绿色滤光
片检测到。
由于这种原因,多色成像时首先使用不产生短波干扰的
激发光对远红外荧光蛋白进行成像。例如,用共聚焦显微镜
多线氩激光对EYFP和EGFP在同一细胞成像时EYFP首先用超EGFP
吸收值的514nm 激发,然后用530-550nm 波段滤光片收集发
射光,发射滤光片不是很关键,因为在这里只有EYFP被激发,
第二次扫描用于成像EGFP. 这里使用458nm 或477nm 氩激光
线激发,然后用非常窄的490-900nm 发射滤光片成像,这种
滤光片可以精确地排除EYFP荧光而吸抓取EGFP的特定光学信
号,虽然488nm 氩激光接近EGFP的最大激发值,但是它非常
接近发射滤光片通带,砗所收集的影像有激光干扰。
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