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本文标题："蔗糖梯度离心质体分离技术与电子显微镜观察"
新闻来源：未知 发布时间：2012-12-11 23:16:53 本站主页地址：http://www.jiance17.com
植物生物技术与食品
第一节 植物组织培养与基因转殖
植物体应处于一种具分裂能力且易于操作的状态下，使转殖基因能藉细胞分裂再分配到其他细胞中，因此首先必须瞭解植物的再生能力如何应用在组织培养及基因转殖。
植物于幼年期或成熟期，于茎干顶端、茎叶交接处、根部尖端之分裂组织(meristem)、甚至叶片中，可进行光合作用之细胞依然保有分裂与分化之能力。
植物再生技术即以植物细胞之分裂与分化能力为基础，配合含无机盐类、维生素、醣类与植物激素之组织培养基来执行。
对植物基因转殖工作而言，小块的植物组织或去除细胞壁的原生质体易于转殖实验操作，且植物组织培养本身即有纯化及量产的目标，故利用植物再生能力建立的组织培养是藉基因转殖大量生产新种植物的重要基础。
第二节 载体媒介基因转殖技术
成功的基因转殖必须先使外源DNA进入细胞中，且插入基因体内并稳定的进行表现产生RNA及蛋白质。良好的载体不但可以携带欲转殖之DNA片段，还可使此DNA片段插入被转殖宿主之基因体中，并且使外源DNA发挥功能。
带有一个特殊质体的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)已被证实可达成上述要求，因此这种会引起植物肿瘤的细菌经过质体修饰后，便成为目前最普遍使用的植物基因转殖媒介。
农杆菌做为植物基因转殖媒介之基础研究
农杆菌基因转殖
以含双载体之农杆菌转殖标的基因
基因转殖效果之确认
农杆菌做为植物基因转殖媒介之基础研究
Ti质体
藉由蔗糖梯度离心质体分离技术与电子显微镜观察，证实有一大型质体存在于农杆菌中。此一200~800 kb之大型质体因可引起肿瘤，故称为Ti质体。
T-DNA
vir基因
T-DNA
农杆菌感染时仅转移一部分Ti质体至植物细胞基因体中，后来被转移之Ti质体片段被称为T-DNA，T-DNA系Ti质体上之一段单股序列。
vir基因
除了T-DNA外，Ti质体上另有一组vir（virulence，即代表致病性）基因，也与农杆菌之植物致病性极有关联。vir基因分为virA~H，virD基因所表现之virD蛋白负责辨识并切割T-DNA。
农杆菌基因转殖
双载体系统为目前在农杆菌植物基因转殖时最常用的，此系统系将Ti质体进行剪裁修饰后获得。
Ti质体载体
载体一同时带有大肠菌与农杆菌之DNA複制起始点，大部分T-DNA区域已移除，只剩可被virD蛋白辨识之LB与RB序列，利用T-DNA移除区域接上标的基因与一筛选用之标识基因。载体二上之virD基因产生virD蛋白，切割LB与RB序列将其中所含之DNA转殖入植物基因体中。
图4-2 以Ti质体上之T-DNA 区域构筑标的与报导基因表现组之二例
基因转殖效果之确认
基因转殖后期工作为确认标的基因已稳定的插入植物基因体DNA内，并且外来基因可随着生殖作用传递到子代中，在实验上可抽取转殖株之总体DNA (total DNA)，以根据标的基因序列设计之PCR引子侦测其中是否含有标的基因。当证实标的基因已插入植物基因体内后，还可利用免疫分析法配合蛋白质活性测试，检测标的基因是否已表现出具有生物活性的蛋白质。
第三节 非载体媒介基因转殖技术
微粒子撞击转殖法
电穿孔转殖法
微粒子撞击转殖法
在转殖技术上，标的基因也可以物理方式直接送入植物细胞中，而微粒子撞击(microprojectile bombardment)或称粒子枪是最常用来取代农杆菌转殖法之直接转殖法。
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