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新闻来源：未知 发布时间：2012-5-27 1:43:17　本站主页地址：http://www.jiance17.com

真菌培养实验步骤主要是？显微镜价格

实验步骤 :

A.真菌之培养

1.利用silicone stopper (00号)先钻孔，再塞脂棉，以作为 2ml microfuge tube 之真菌好气培养之用途。

2.取2ml microfuge tube，加入0.5 ml 之YM broth，塞紧上述之silicone stopper。

3.置放于试管架以autoclave (121℃ / 15 min.)灭菌15分钟，并以非常缓慢的方式排气，以防silicone stopper弹开。

4.冷却后，在无菌操作台以接种铒由保存之菌种( Aspergillus oryzae)接入分生孢子，塞紧后以28℃培养3~5天。

B.真菌Genomic DNA之分离

1.取出silicone stopper 放入75%之酒精溶液杀菌，盖紧 2ml microfuge tube 本身之盖子，之后

(1).以Vortex 振盪或用Tip将管壁上的菌丝拨离，再利用离心机(10000 rpm) 离心3分钟；

(2).用 micropippet 吸取1 ml 的上清液并将之舍去不要，之后加入 1 ml 无菌水，经Vortex 振盪后再利用离心机(10,000 rpm) 离心3分钟；

(3).步骤同1-(2)，即用 micropippet 吸取1 ml 的上清液并将之舍去不要，之后加入 1 ml 无菌水，经Vortex 振盪后再利用离心机(10,000 rpm) 离心3分钟。

2.离心后，倒除上清液，放进一支已灭过菌的研磨棒稍作搅拌，来把菌丝团分散，手戴棉手套(以防止冻伤)，之后把菌丝团连同 2ml microfuge tube 以镊子挟住放入液态氮中作菌丝冻结，取出后，转动研磨棒来研磨菌体。

3.取出研磨棒后，于microfuge tube内加入400μL AP1 buffer 及 1μL RNase A solution，把microfuge tube的盖子盖上后，用Vortex 振盪后，把microfuge tube插进有孔洞的保丽龙板上，再将插有microfuge tube的保丽龙板置于65℃的水浴中，保持15分钟，而其中每2-3分钟要将microfuge tube拿出稍作摇盪(可用手指弹)，要注意的是，在每2~3分钟将tube拿出稍作摇盪所花费时间要扣除，即不能算在15分钟内→ 此步骤是为了将细胞及细胞核水解掉,以释出DNA。(注意！在15分钟的等待过程中，可以拿盒子去制冰机那儿盛装一些碎冰，因为下一步骤4马上要作冰浴的动作。当第3步骤结束后，可先将第10步骤中所需的AE buffer 放入65℃的水浴中加热保温)。

4.将microfuge tube从65℃的水浴中取出后，加入130μL AP2 buffer，把microfuge tube的盖子盖上，稍作上下摇晃混合后，利用刚刚盛装的碎冰作冰浴的动作，需保持冷却5分钟。

5.将混合的液体倒进过滤管(shredder column)中(因为在此我们采用的是QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit中的column，而这一类的column是装在2 ml collection tube内的，即column与collection tube是一套的)，用离心机(10,000 rpm)离心2分钟。即经过column流出的滤液是装盛在下面的collection tube中。

6.离心后，取出过滤管(置灭菌袋)，并将滤出在 2 ml collection tube的滤液中吸取340μL 至一个新的1.5 ml microfuge tube，之后加入170 μL AP3 buffer 及340 μL 95%酒精 (注意：酒精与AP3 buffer的比例要 2:1，而加入95%酒精是为了让DNA沉淀)，并用吸管上下吸取作混合(此时混合的体积共有原来340μL 的滤液 + 170 μL AP3 buffer + 340 μL 95%酒精 = 850μL 的混合滤液)。

7.将850μL 的混合滤液以spin column分二阶段进行DNA吸附：

(1).将microfuge tube内混合的滤液先吸出650μL 至spin column中(这里的spin column也与一2 ml collection tube成套的，即spin column是装在2 ml collection tube中)，用离心机(10,000 rpm)离心1分钟。将离心后滤出在 collection tube的滤液丢弃 (但是此时还不要把collection tube丢掉)；另外，注意千万不要也把spin column丢掉，因为我们要的东西是吸附在spin column上。

(2).再取出步骤6 microfuge tube内剩馀的混合滤液约200μL (即850μL 混合的滤液 –之前吸出的650μL滤液= 200μL 滤液) 倒进原来步骤7-(1)的spin column 中，之后用离心机(10,000 rpm)离心1分钟。我们要的东西是吸附在spin column上。

8.将流出的滤液连同collection tube一起倒掉，之后将spin column 装进一新的2 ml collection tube中，加入500 μL AW buffer，再用离心机(10,000 rpm)离心2分钟。

9.倒掉滤液(但是collection tube本身不要丢弃)，再于spin column中加入500μL AW buffer，再用离心机(10,000 rpm)离心2分钟。取出spin column (而此时可将collection tube丢掉)。

10.将spin column再装进另一新的1.5 ml microfuge tube中，之后加入50μL 事先于65℃保温的AE buffer (为了要溶解原先吸附在spin column上的DNA)，把盖子盖上后，继续在65 ℃中保温5分钟，再利用离心机(10,000 rpm)离心1分钟。如此即可在microfuge tube内得到DNA，再将DNA放置 -25℃ 以下的温度作保存。