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本文标题："探针浓度2 ng/μL明显不足，而无法得到最强的萤光"
以多聚甲醛与酒精两种固定剂对E. coli (G-)、Bacillus subtilis (G+)的固定效果实验中，由显微镜观察后发现以酒精固定的部分经过打散之后，细胞受到较严重的伤害，而导致细胞的杂交萤光也相对减弱。因此，在液体杂交方面无论是固定剂对细胞结构之完整性或其对萤光强度的影响，多聚甲醛的固定效果皆比酒精为佳。
于SDS浓度的最佳化分析中，在E. coli方面，最佳浓度为0.05 %，而在低浓度0.01 % 时，推测因为浓度过低导致细胞的穿透性不佳，探针无法顺利的完全进入细胞内进行杂交；而推测0.5 % SDS使探针萤光减弱的原因有两个，一为此高浓度的SDS在数小时的杂交过程当中将细胞壁给部分溶解(lysis)，使细胞内的物质(包含RNA)有外渗的现象；其次为SDS不仅为一种介面活性剂，也是一种核酸变性剂，当浓度太高时会改变杂交条件的严格度，使探针不容易与目标rRNA杂交上所致。在B. subtilis方面，SDS浓度的影响并不明显，推论两者不相同的原因为：E. coli是属于革兰氏阴性菌，其细胞壁含有大量的脂质，这些脂质较易受SDS的影响而分解，进而增加了细胞的穿透性；而B. subtilis属于革兰氏阳性菌，其细胞壁结构含有大量的呔聚醣(peptidoglycan)，且几乎不含脂质，这些由多层 peptidoglycan所连接而成的网状组织构成了厚且坚硬的细胞壁而不易受SDS的影响。
在探针浓度之实验结果显示：
1. 在所控制的菌量下，探针浓度2 ng/μL明显不足，而无法得到最强的萤光。
2. 探针浓度由3 增加至10 ng/μL所获得的平均萤光强度已不再明显提升，最佳之探针浓度应在3 ~ 5 ng/μL之间。
3. 加入高浓度的探针 (5 ng/μL以上) 并无法有效提高萤光强度，在萤光显微镜下观察，发现反而会提高探针非专一性键结的机会。
在pH值对fluorescein萤光强度的影响实验中，结果发现当杂交步骤完成之后细菌悬浮液之pH为7.2时萤光强度明显弱于pH值8.4时，因此液体杂合之保存液PBS的pH值应调整为8~9之间。
活性污泥中含有许多非细胞之颗粒杂质，使用Flow Cytometry分析时也都会被一一的侦测到，产生出巨大的背景杂讯，本实验成功测试出最佳之PI (会与双股DNA或RNA结合之核酸染剂 )浓度，可于单雷射光源(488 nm)之Flow Cytometry分析时对活性污泥中的细胞进行筛选，将其从杂质颗粒区分出来，并利用FISH结合PI染色之双重染色法进行活性污泥族群结构之分析。
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