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本文标题："ABI 310型核酸自动排序仪做排序用说明？"
使用ABI 310型核酸自动排序仪
做排序用
说明：
1. 此仪器採雷射光侦测在毛细管电泳中, 不同颜色标定之ddNTP核酸合成中断法之颜色, 而以电脑软体判读排序. ABI 310在使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit时, 採E型滤光模式侦测.
2. 目前本校採购本ABI 310型核酸自动排序仪的美商应用生命科学仪器公司有2种套组供核酸自动排序仪使用, 其一为ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, 另一为ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0. 其中v2.0用于较长段的核酸排序, 但2者的protocol 完全相同, 均可用于单股, 双股, PCR成品等之排序之用, 採购时以v2.0为佳.
3. 上述kits中, Taq polymerase, buffer等均己溷在一起便于使用.
4. 若需软体部份, 可由http://www.pebio.com/ab/techsupp/310.html download.
5. ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with AmpliTaq FS v2.0, 分别有可使用100(採购编号#4303149)次, 或1,000(#4303150)次等多种. 可依用量选购, 此Kit应保存于-20℃.
6. 在template的使用量上,参考下表:
PCR product(必须纯化):
100~200bp 1~3ng
200~500bp 3~10ng
500~1000bp 5~20ng
1000~2000bp 10~40ng
>2000bp 40~100ng
Single-stranded DNA 50~100ng
Double-stranded DNA 200~500ng
Cosmid or Bacterial artificial chromosome (BAC) 0.5~1.0μg
Bacterial genomic DNA 2~3μg
7. 整个排序用样最终体积为20μl, 包括8μl DNA template, 4μl primer, primer的浓度为0.8pmol/μl, 若将primer的浓度提高为4.2pmol/μl, 则可只用1μl, 而template则可用到11μl. 另8μl为Cycle sequencing mix.
8. 本仪器软体均已由厂商代为装妥, sequencing data collection于电脑开机即可使用, 在分析时则另以分析软体行之. 有需校对仪器时, 可用ABI 310 diagnostics system软体, 对整个仪器校对约需9min. 排序完成后, 可用Factura Identification Software整理结果.
执行plasmids 与PCR products的sequencing步骤：
先执行Cycle sequencing, 在本校的RoboCycler 40型thermal cycler执行. 用0.5ml的离心管, 加入：
Terminator Ready Reaction Mix 8.0μl
Template 如说明5
Primer如说明6
上3项合计20μl,若不足,加去离子水.
1. 充分溷合后, 离心3,000rpm, 5sec, 再加40μl mineral oil.
2. 然后进行反应96℃ 30sec, 50℃ 15sec, 60℃ 4min, 25cycles. 然后取出, 离心3000rpm, 5sec.
3. 再进行纯化(使用Bio-Rad Quantum Prep PCR Kleen Spin Columns –步骤为先将column中的resin缓速vortex 10sec, 将底部帽取下, 将column置入1支2.0ml离心管中, 离心750xg, 1min, 再将column置入1支1.5ml已高温高压消毒过的离心管, 将要纯化的DNA吸入管中, 离心750xg, 2min, (速度不可太高, 时间不可超过2min) 所得即为纯化DNA).
※有关xg换算为rpm的参考公式如下：
xg＝1.12×105×r
(r为由轴心至离心管正中间之半径cm值×rpm2)
或
xg＝11.18×r×(rpm/1000)2
若为BAC DNA,则用0.5ml的离心管,加入
Terminator Ready Reaction Mix 16.0μl
Template 如说明5
Primer 5~10 pmol
上3项合计40μl, 若不足, 加去离子水.
1. 充分溷合后, 离心3,000rpm, 5sec, 再加40μl mineral oil. 然后进行反应25 cycles.
2. 然后取出, 离心3000rpm, 5sec.
3. 再进行纯化.
若为Bacterial Genomic DNA, 则用0.5ml的离心管, 加入：
Terminator Ready Reaction Mix 16.0μl
Template 如说明5
Primer 6-13 pmol
上3项合计40μl, 若不足, 加去离子水.
1. 充分溷合后, 离心3000rpm, 5sec, 再加40μl mineral oil.
2. 然后进行反应25 cycles. 取出, 离心3000rpm, 5sec.
3. 再进行纯化.
※若无Quantum Prep PCR Kleen Spin Columns,可採沉淀纯化法:
(1). 将PCR的结果吸入一支1.5ml离心管, 儘量不沾mineral oil.
(2). 再加入80μl 75﹪isopropanol, 缓速vortex 10sec, 置室温15min, 离心13,000rpm, 20min, 将上清液吸除.
(3). 加入250μl 75﹪isopropanol, 缓速vortex 10sec, 离心13,000rpm, 5min, 将上清液吸除.
(4). 将管盖打开, 置heat block上90℃, 1min, 使乾燥.
※亦可採用酒精沉淀法：
(1). 将PCR的结果吸入一支1.5ml离心管, 儘量不沾mineral oil.
(2). 再加入16μl去离子水, 64μl 95﹪ethanol, 缓速vortex 10sec, 置室温15min, 离心13,000rpm, 20min, 将上清液吸除.
(3). 加入250μl 70﹪ethanol, 缓速vortex 10sec, 离心13000rpm, 5min, 将上清液吸除.
(4). 将管盖打开, 置heat block上90℃, 1min, 使乾燥.
※亦可採用酒精与醋酸钠沉淀法：
(1). 将PCR的结果吸入一支1.5ml离心管, 儘量不沾mineral oil.
(2). 再加入2μl的3M sodium acetate, 50μl 95﹪ethanol, 缓速vortex 10sec, 置室温15min, 离心13000rpm, 20min, 将上清液吸除.
(3). 加入250μl 70﹪ethanol, 缓速vortex 10sec, 离心13,000rpm, 5min, 将上清液吸除.
(4). 将管盖打开, 置heat block上90℃, 1min, 使乾燥.
使用ABI 310排序仪:
1. 将前所得样本溶于25μl的Template Suppression Reagent(TSR)中(随polymer提供), 缓速vortex 15sec, 离心1000rpm, 10sec, 置heat block 95℃, 2min, 并立即置冰上, 待用.
2. 要用多少样本量与DNA模子的品质, 引子功能等均有关, 但最少需要10μl. 将样本(>10μl)吸入0.5ml管中, 盖上塞子. 缓速vortex 15sec, 离心1,000rpm, 10sec, 置heat block 95℃, 2min, 并立即置冰上, 待用.
3. 将准备好的tubes置机器之样本管架上, 并在纸上记下每支管之样本名及排列位置.
4. ABI 310 用performance optimized polymer 6(POP-6此6代表6﹪)做为毛细管电泳材(採购编号P/N[part number] 402844其中包括2瓶TSR). 在GeneScan时用POP-4(4﹪)(P/N 402838)及10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA (#402824)(使用时稀释为1x).
5. 毛细管可至少供100次样本用, 不用时需洗淨并将两头浸入deionized water中. 毛细管的窗户部份不应手握, 有灰可以酒精擦拭.
6. 若run 600-base, 用61cm毛细管(粉红色注记), 用Seq POP6 E run module, 200v/cm, 约120min. 若run 400-base, 用47cm毛细管(绿色注记), 用Seq POP6 Rapid E run module , 320v/cm, 约35min. 温度均为50oC. 以上均用1ml针管, BD set any primer. 并使用CE-1 basecaller.
7. 将pump block以自来水洗淨, 再以dH2O冲洗, 以吹风机风乾, 用1.0ml玻璃针筒缓缓吸0.2ml POP-6, 将针杆抽吸数次, 再缓缓吸入0.5ml POP-6, 若有气泡必须将针筒直立待汽泡上升, 加以排出.
8. 再以蒸馏水清洗针筒外部, 并以Kimwipes擦乾, 将针装于定位, 关紧废料口, 并旋紧左侧上方供装塑胶针筒的Luer valve, 装好毛细管, 毛细管左瑞正好在针筒下出口之前, 旋紧毛细管接头, 毛细管另一端(右瑞)须超过细铁柱0.5mm, (细铁柱先以dH20擦淨, 擦乾). 视窗处通过laser光眼, 关好黑色盖, 其馀部份以黄色耐热胶布贴在白色加热板上.
9. Turn on仪器, 由电脑中选"about collection software", 在Manual control window点Function pop-up menu, 再点autosampler present tray再点execute, 此时autosampler tray会退出, 将samples置于tray上, 再选Function, 点autosampler return tray, 再点execute, tray就退回定位, 即可将右侧门关上. 再选Instrument视窗, 点Change capillary, 按reset, 使injection counter为0.
10.此时, 取13.5ml dH2O＋1.5ml 10x running buffer溷匀, 加入buffer valve chamber至红线处, 再加入vial 1至黑线处. 将有红线之玻璃小杯装妥, 将vial置tray之位置1, 置另一含dH2O之vial 2于位置2, 均加上有孔盖, 再取1去盖1. 5ml离心管装dH2O置位置3.
11.此时设定Syring Max Travel值, 在电脑上选Manual control window, 选Function, 再选Syring Home, 再按execute, 再选Syring Max Travel, 点Syring down, 按execute, 每按1次, toggle会向下一点, 按至toggle与针杆相接即停, 再选Syring up, 输入250值再按execute.
12.再选Buffer valve close, 按execute, 将玻璃针筒下方接头略鬆一点, 将针杆推一点, 使下方接头之白色管头现出1滴polymer以去除空气, 再将下方接头旋紧. 再选buffer valve open, 按execute, 将针杆推一点使polymer充填至左侧上方接头之下近斜坡管处, 再选buffer valve close, 按execute, 再选Syring down, 按execute, 可多按几次, 使polymer充至斜坡管内满为止. 再由function中选temperature, 设定为50℃, 按execute.
13.此时选Autosampler calibration, 按start, 再按ABI 310机器左侧之tray键, 使tray移动一下, 选autosampler home x, y, axis, 再按execute, 再选autosampler Z axis, 再按execute, 再选syring home, 按execute. 关上机器所有之门.
14.由File项选new, 再选sequence sample sheet 48 tubes, 输入sample名称, quit此window, 再按save, 第2次再按save. 再由file, 选new, 再选sequence injection lift, 选sample sheet, 选出方才建的档名, 再选A1-1即第1行第1格. 此时选Edit, 再选insert, 选一个名称, 按绿色箭头即run. 仪器自动run至结束. 若再续run, 先quit injection lift, 再save, 再选autosampler present tray 按execute, 取出旧samples, 放入新samples, 再按return tray, 再选syring home x,y,…..依前述步骤.
15.分析Data, 用sequence analysis, 选add file, 再选ABI 310, 按ABI Prism 310, 按open, 按runs, 再按open, 选所要的file, 按open, 选要分析之sample, 按add file, 再按done, 再按start, 按sample file之名, execute, 即可看结果, 再按P, 按start, 即可印出.