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本文标题："使用基因枪转植基因注意事项有哪些？"
使用基因枪转植基因
注意事项：
1. 切勿将枪口对人.
2. 事前备妥polyvinylpyrollidone(MW＝360,000,100g约750元), Spermidine(Sigma #S-0266, 5g约3,500元). 99.9﹪酒精. 15ml与1.5ml离心管, 0.05M Spermidine, 1M CaCl2, 20mg/ml polyvinylpyrollidone (溶于酒精) 使用前取少量稀释成0.1mg/ml, 准备3.5ml以供50发子弹用,
3. 每50发子弹, 用35mg金粉 (直接置入离心管测), 100μg DNA (浓度＞1μg/μl). 管子长76cm. 以3.5ml液状充填.
4. 子弹准备架左方有2个小胶圈(O-rings), 及枪喷口有1个小胶圈, 用久磨损须更换.
步 骤： (每50发子弹用)
1. 将35mg金粉(直接置入1.5ml离心管测), 加入100μl之0.05M Spermidine, vortex 5sec, sonicate 10sec.
2. 加入100μg DNA(若同时转植1种以上基因, 等量加入), vortex 5sec.
3. 加入100μl 1M之CaCl2, 以低速vortex 5sec, 再置室温使沉淀10min, 离心4,000rpm, 15sec, 吸除上清,
4. 加入1ml 99.9﹪酒精, 以低速vortex 5sec, 离心4,000rpm, 15sec, 吸除上清, 如此, 重覆3次, 吸除上清.
5. 加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 0.5ml, 以低速vortex 5sec, 将管内物全部吸入15ml离心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml加入原1.5ml离心管中, 再以低速vortex 5sec, 将管内物再全部吸入15ml离心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml 加入原1.5ml离心管中, 再以低速vortex 5sec, 将管内物再全部吸入15ml离心管中, 再于15ml离心管中加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml, 再以低速vortex此15ml离心管5sec, 此时可将此管保存于-20℃. 或接下列步骤.
6. 将子弹准备架安置好, 并通入N2, 将76cm子弹管由右侧插入, 直通至左侧环内1cm, 将氮气开关调至0.3~0.4, 并吹气入管15min.
7. 关掉氮气开关, 将管取出, 将一端插入接有软接头的10ml针筒管, 将子弹管另一端置入含3.5ml黄金粉, DNA的液体中(此液体需先以低速vortex 10sec, 两sonicate 30sec, 并立即使用), 以针筒吸取液体至子弹管长64cm处, 将子弹管取出, 但是再以针筒吸子弹管中液体, 使子弹管两端均留下约6cm空白, 立即将子弹管插入准备架, 并等5min, 使金粉粘在管壁, 再以针筒以2cm/sec的速度将子弹管中酒精吸除.
8. 取下针筒, 将准备架旋转开关打开, 使转动30sec, 再打开氮气, 使子弹管乾燥5min, 关氮气, 停转, 将子弹管取出.
9. 检查子弹管, 看金粉是否均匀分佈, 将不良部份以签字笔注记, 以便切成子弹时弃之.
10.将子弹保存盒(含乾燥剂)置切子弹器下, 将子弹管插入切子弹器, 开始切子弹, 完成后将子弹保存盒标示清楚, 盖好, 并以parafilm封好, 保存于4℃. 在使用前将子弹装入弹夹, 将弹夹以"12"向上装至定位.
11.将氦气接好, 调至400psi, 最大至600psi, 准备射击. 射击后, 取下弹夹, 关氦气总开关, 将氦气调节阀逆时针转, 排气, 再拆下接管.
12.若射击动物附着细胞, 吸除培养液后为之, 浮悬细胞则以5×107cells/ml浓度, 取20μl, 滴于培养皿上, 使分佈直径小于1.5cm, 若射击动物皮层, 先剃去毛, 用70﹪酒精消毒后为之.
若要以RNA取代DNA, 则不用CaCl2, 与polyvinylpyrollidone而用5M ammonium与2-propanol来将RNA附在金粉上. 其步骤类同处理DNA.
简述如下：
1. 量35mg金粉, 加入液体mRNA, (5μgRNA/mg金粉), 加入液体mRNA体管1/10量的5M ammonium与2倍量的2-propanol, vortex 15sec, 离心离心4,000rpm, 15sec, 吸除上清.
2. 加入1ml 99.9﹪酒精, 以低速vortex 5sec, 离心4,000rpm, 15sec, 吸除上清.
3. 加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 0.5ml, 以低速vortex 5sec, 将管内物全部吸入15ml离心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml 加入原1.5ml离心管中, 再以低速vortex 5sec.
4. 将管内物再全部吸入15ml离心管中, 再以0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml加入原1.5ml离心管中, 再以低速vortex 5sec.
5. 将管内物再全部吸入15ml离心管中, 再于15ml离心管中加入0.1mg/ml之polyvinylpyrollidone 1ml, 再以低速vortex 此15ml离心管5sec, 此时可将此管保存于-20℃. 即成.