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本文标题："限制酶切割形成有交叉缺口之双股DNA"

建构重组DNA

    本实验仅以均经限制酶切割形成有交叉缺口之双股DNA行之. 将嫁接媒介与所要构建进入媒介的DNA适量溷合, 加入1μ的T4 DNA ligase, 再加入适量ligase buffer及适量BSA, 置25℃, 2hr, 此种建构方式会产生因随机结合的各种不同重组DNA, 亦有多于一段以上所要的DNA同时构建入同一媒介者. 再以电泳分离之. 再将构建好的媒介转植入宿主细胞, 并使之增殖, 再将含重组DNA的细胞保存于甘油液中, 保存在-70℃.

    若欲检测所要的DNA是否已进入某一宿主细胞中, 可将此宿主细菌以涂平盘法长在平盘上再以nylon滤纸盖上, 将菌群模印在nylon滤纸上, 再将此滤纸以铅笔做上正面(有菌群)之记号, 并以尖针在滤纸上刺四处小孔, 并与培养皿上的相对位置标好, 如：

    再将此nylon滤纸放在一张吸满0.5M NaOH的滤纸(普通滤纸)上, 5min, 再将nylon滤纸在移放在另一张吸满1M Tris. Cl, pH7.5的普通滤纸上, 5min, 再将nylon滤纸移放在另一张吸满0.5M Tris. Cl, pH7.5/1.2M NaCl的普通滤纸上, 5min, 接下来将此nylon滤纸置已自动设定之UV Crosslinker中, 使DNA固定, 再进行南方式杂交, 以DNA探针找出所要DNA的菌群位置, 则可在原始培养皿上找出所要的菌群. 此nylon 滤纸可先以铝箔纸包好高温高压消毒以达无菌状态. 在印取菌群时, 勿让nylon滤纸与平盘间有空隙.