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本文标题："了解溷浊度和活菌数目之间的关系"
溷浊度和活菌数的关系(Relationship between
Turbidity and Live bacteria)
目的：
1. 了解无菌操作的方式
2. 了解溷浊度和活菌数目之间的关系
3. 瞭解如何做稀释
原理：
简介大肠杆菌(Escherchia coli)
大肠杆菌的品系(strains)
E. coli B/r (HB101) wild type
E. coli TOP10F’ F’{lacIq, Tn10(TetR)} mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC) ψ80lacZ△M15
△lacX74 deoR recA1 araD139 △(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR)
菌种的纯化( Strain purification)
1. Overnight culture (O/N) — 用接种环或药匙经消毒后，从甘油储存菌种或LB平板
上取出（沾一下）菌，接种于3-5 ml的LB（含有适当的氨基酸或是抗生素），在
37 ℃下震盪培养隔夜（14-18 小时）。
2. Dilution buffer — 灭菌过的100 mM MgSO4
3. Isolation of single colonies — 刚拿到手的菌种或是从甘油储存菌种要开始作实验
前，菌种需先纯化﹕用单一菌落﹔得到单一菌落的方法有二﹕（1）从O/N culture 用
100 mM MgSO4去做一连续的十倍稀释，用接种环从高稀释度开始取出稀释液，
涂抹在LB平板上﹔（2）用接种环沾取O/N culture或菌落涂抹在LB平板的一边
（a），接种环经消毒后，再从第一次涂抹的地方把菌涂抹开，以便得到单一菌
落（b1-b4）。若是新到手的菌种，在得到单一菌落后，先根据基因型去测试菌
种。
4. 菌种保存﹕glycerol (10%) or DMSO (7%) storage (at –70 ℃)
测量细菌的浓度 (cells/ml)
用溷浊度﹑细菌数目和活菌数目来测定。
溷浊度 — 其原理是可将细菌视为悬浮颗粒，这些颗粒可阻断光线的通过，因此
细菌浓度愈高，通过的光线愈少，就等于吸光值愈大，然而我们不认为它是吸
光值，只是细菌将光线散射掉了，因此我们用溷浊度表示﹔大多数时候我们是用
LB来培养E. coli，因为LB的颜色是黄色，所以用分光光度计去测量细菌浓度时，
波长选用600 nm﹔若是用minimal medium来培养E. coli，因为minimal medium的颜
色是无色，所以用分光光度计去测量细菌浓度时，波长选用460 nm。用溷浊度来
测量细菌的浓度只是估计值，正确数目则需用下列方法决定之。
细菌数目— 使用Petroff-Hauser Chamber在显微镜下数细菌的数目，在这
Chamber内约有100格，每格的体积为10 µl﹔在使用此Chamber需要将此玻片的两面
清乾淨，尤其不能有任何的纤维残留，因为纤维会将细菌和培养液分隔开而造成
菌数分配不均，进而影响精确度。盖玻片是否确实盖好也是影响精确度的重要因
子。
活菌数目— 上一项的方法将死和活的细菌数目均计算在内，所以活的细菌数目是
用一连续的稀释菌液后，取0.1 ml的稀释液涂抹在LB平板上等菌落长出后，数其
菌落数，即可推出每ml的活菌数目。
器材：
培养基(LB)
100 mM MgSO4溶液
37℃培养箱(incubator)
方法：
1. 向助教领取两种（年轻和年老）的菌液，分别作1/2（年轻）和1/4（年老）的稀
释，先用分光光度计以600 nm波长去测量稀释液的溷浊度，并纪录其值。
2. 用此数据1 OD600= 1-3 X 108 cells/ml去推算约略所需要的稀释度，以便在取用0.1
ml的稀释液去涂抹在LB平板时，可得到菌落数为30-300个。
3. 稀释菌液用10 mM MgSO4溶液。
4. 稀释后用三种连续稀释度，如10-1﹑10-2和10-3，取两次0.1 ml的稀释液分别去涂抹
在LB平板（共6个LB平板），等到LB平板上所有的液体不见后，将平板倒置并
放置于37 ℃培养箱，次日中午以前到助教处数菌落数。
5. 请讨论为何从年轻和年老的菌液所得的菌数有差异，和前面的实验又有何关联﹖
6. 请和实验一的数据作比较，提出一个假说。用下星期的实验数据来验证。
杀过菌的玻管
细菌展开用的玻棒
培养基平板