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本文标题："初级细胞的初代培养-显微镜下观察神经细胞的型态"
湿度固定、空气成分含百分之五之二氧化碳（5%CO2/95%
Air）培养箱。每两天替换新鲜10％FBS之DMEM/F12，培养细胞至第九天进行实验。
二、初级细胞的初代培养(Primarymixglialculture)
以麻醉剂pentobarbital将出生1天之鼠牺牲后，将其大脑
皮质组织置于内含penicillin-streptomycine、fungizone及
HBSS配置成的solutionD中，清除血管与残馀软脑膜后以机
械方式绞碎。将脑组织浸泡在细胞培养液及0.25%胰蛋白脢
消化液（Trypsin-EDTA）中，在37℃水浴槽静置5分钟待细
胞沉淀，去除上清液，加入含有10％FBS(FetalBovineSerum)
DMEMF-12培养液，离心(2000rpm)10分钟。去除上清液，
加入新的细胞培养液并以电动吸管（Pipet）反覆吸放数次，
溷合均匀，以纱布过滤不要的组织块。细胞悬浮液以血球计
数器计算细胞数，再分种于预先舖有poly-L-lysine（0.02g/L）
。
处理过的12孔细胞培养皿内（细胞数约为5×105cells/well）
细胞培养于37℃、湿度固定、空气成分含百分之五之二氧化
碳（5%CO2/95%Air）培养箱。每两天更换10％FBS之
DMEM/F12之培养液，培养9-12天取用细胞进行实验。
贰、细胞免疫染色（Immunocytochemicalstaining）
透过细胞免疫化学染色法分别鑑定培养之神经细胞与溷
合胶质细胞，以glialfibrillaryacidicprotein（GFAP）之抗体
标示星状胶质细胞，以微小管相关蛋白质-2（microtubule
associatedprotein-2，MAP-2）之抗体标示神经细胞，以OX-42
之抗体标示小神经胶细胞。药物实验后，给予4％福马林固定
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二十分钟，先将样本以PBS清洗二次，目的为洗去固定液，
以0.4％TritonX-100与1％BSA溷和溶入PBS製成的Blocking
soluyion处理30分钟，以PBS清洗后分别加入所需之一级抗
体（primaryantibody），包括
anti-MAP-2，存放于4℃反应24小时后以PBS清洗一次，使
用二级抗体（biotinylated
immunoglobulins）反应2小时以PBS清洗一次，加入ABC
solution反应30分钟，以PBS清洗一次以DAB加5％H2O2
进行呈色反应，并于显微镜下观察神经细胞的型态。
anti-GFAP、anti-OX-42、
anti-rabbit
and
anti-mouse
参、细胞伤亡测试
一、定性:
(1)藉由显微镜观察细胞型态的变化，了解细胞受损的情
况。
(2)
A.原理：
Trypanblue会直接进入死细胞中而呈色，而活细胞膜完
整且具有选择性通透性，染料无法渗入而不会呈色，由此
可得知细胞存活率，此法又称色素排除法。
Trypanblue染色法:
B.步骤：
trypanblue（0.4%）与细胞培养液以1:1比例充分溷合，
1ml/well加入培养皿，静置30分钟后以PBS清洗至乾
淨，显微镜检查其染色状况。
二、定量：
MTTassay:
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A.原理：
药物处理过的细胞，其存活率（cellviability）可以MTT
还原法评估。健康细胞可产生较多之能量供细胞代谢粒腺
体内的琥珀酸去氢酶(succinatedehydrogenase)能将MTT
3,(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)
bromide)由黄色还原为紫色之formazan结晶颗粒，而还原
力的强弱，即可代表琥珀酸去氢酶之活性，也就是代表代
表细胞之生理状况以及存活率（Manthorpeetal.,1986）
。
2,5-diphenyl-tetrzolium
B.步骤：
药物实验后，将溶入0.1MPBS之MTT（5mg/ml）经
0.22µmfilter过滤，以1：9之比例加入细胞培养液，置
于培养箱中约
Isopropanol1000µl/well并反覆冲洗以便将结晶之MTT
完全溶解，取其溶解后之液体置入分光光度计中
（SHIMADZU，UV-1601，Japan）以波长570nm测定
，
MTT反应的量。
另将培养皿置于倒立显微镜下观察型态，藉由观察细胞
型态的变化，瞭解细胞受损的情形。正常健康的神经元细
胞会呈现平滑之椭圆或圆的外型及直径一致，外型平滑的
轴突。死亡的细胞外观呈现细胞膜不完整，细胞萎缩、破
裂以及轴突断裂的现象。
1小时后，将上层液体吸除，加入
第三节、资料之统计与分析
将实际测得之数值平均后，以平均值加减标准误（Mean
±SE）为製作图表之依据。并使用SigmaPlot套装软体，进行
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重複变数单因子变异数分析（One-wayANOVA）来分析各组